抗人大腸桿菌免疫雞蛋黃抗體的研究

    高免蛋黃抗體具有生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單、效率高等特點(diǎn)，已越來(lái)越多地應(yīng)用于人類(lèi)許多疾病的預(yù)防和治療以及生物學(xué)的高度特異性檢測(cè)等領(lǐng)域中，并取得顯著成效。本文主要研究了以人致病性大腸桿菌為抗原，免疫母雞，研究獲得含有價(jià)蛋黃抗體的雞蛋的*條件；建立快速、準(zhǔn)確、定量的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定蛋黃抗體（IgY）效價(jià)的技術(shù)；研究抗人大腸桿菌IgY分離純化條件及其理化、生化特性；研究食品加工過(guò)程中的各種因素對(duì)大腸桿菌特異IgY生物活性的影響；探討抗人大腸桿菌免疫雞蛋抗體的功能及其機(jī)理；評(píng)估蛋黃抗體的安全性。

    主要獲得如下結(jié)果：

（1） 對(duì)獲得含有價(jià)蛋黃抗體的雞蛋的*條件研究發(fā)現(xiàn)： （a） 以大腸桿菌懸浮液對(duì)20周齡京白蛋雞免疫時(shí)，若固定免疫抗原劑量為0.5ml，則當(dāng)菌液濃度低于1×10~9 cfu／ml，免疫應(yīng)答強(qiáng)度隨免疫劑量的降低而降低，當(dāng)菌液濃度高于1×10~9 cfu／ml時(shí)，免疫應(yīng)答強(qiáng)度不會(huì)隨免疫劑量的增加而得到明顯加強(qiáng)。因此，確定*免疫劑量為每次0.5ml菌液濃度為1×10~9 cfu／ml的大腸桿菌懸浮液。 （b） 在大腸桿菌懸液中添加等量的福氏*佐劑、福氏不*佐劑和白油佐劑能明顯加強(qiáng)免疫應(yīng)答強(qiáng)度，其中福氏*佐劑對(duì)免疫應(yīng)答加強(qiáng)的程度zui高。 （c） 胸部皮下注射、翅下皮下注射、大腿皮下注射、頸背皮下注射、胸部肌肉注射、翅下肌肉注射、大腿肌肉注射和頸背肌肉注射8種不同免疫途徑對(duì)免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)度沒(méi)有明顯影響。 （d） 強(qiáng)化免疫程序能大大加強(qiáng)產(chǎn)蛋母雞的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，其中初免后，每隔1周強(qiáng)化免疫一次，連續(xù)4次，此后每1月僅用佐劑抗原強(qiáng)化免疫1次的強(qiáng)化免疫程序既經(jīng)濟(jì)又有效。

（2） 采取熱酚法提取E.coli LPS作為抗原，以酶標(biāo)記的兔抗雞IgY抗抗體（IgG）為二抗建立起來(lái)的間接ELISA技術(shù)檢測(cè)特異蛋黃抗體IgY的抗體效價(jià)，以酶標(biāo)二抗工作濃度為1：2000，LPS抗原包被濃度為1：20（10ug／ml），可以檢測(cè)到雞特異IgY抗體效價(jià)為1：10240。用豬源EHEC和人源沙門(mén)氏菌的LPS抗原進(jìn)行了交叉檢測(cè)，表現(xiàn)出高度的特異性。

（3） 通過(guò)對(duì)蛋黃抗體（IgY）的分離純化條件研究發(fā)現(xiàn)，乙醇沉淀抗體的*條件是粗提液：乙醇（V／V）為1：0.35；經(jīng)DEAE-Sephrose fast-flow離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠排阻層析連續(xù)純化后可得到電泳純的抗人大腸桿菌IgY，其MW為186400Da（電泳法）或186500Da（凝膠過(guò)濾法），該抗體由兩個(gè)亞基構(gòu)成，分子質(zhì)量分別為65900Da和24600Da，其等電點(diǎn)為5.5。

（4） 通過(guò)穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)： （a） 抗人大腸桿菌IgY抗體在高溫下（≥75℃）容易發(fā)生熱變性，其熱變性的反應(yīng)級(jí)數(shù)為1.5，其熱變性溫度點(diǎn)為75.0℃。 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)博l:學(xué)位論文 （b）抗人大腸桿菌抗體在酸性環(huán)境容易發(fā)生變性，而在中性和弱堿性環(huán)境中能較好的保 持穩(wěn)定，其主要變性發(fā)生在pH2.5一3.0。 （c）胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對(duì)抗人大腸桿菌抗體的活性保持均有不利的作 用，但發(fā)現(xiàn)，經(jīng)上述3種消化道蛋白質(zhì)水解酶部分作用后形成的抗體水解物仍具有一定的抗 體活性。進(jìn)一步研究確定，在灌胃后lh內(nèi)，小腸內(nèi)抗體活性基本保持在zui高水平，而在Zh 之后，抗體活性大幅度下降，在灌胃后16h已經(jīng)下降到了非常低的水平。 （d）將抗人大腸桿菌抗體貯存在O℃和4℃是比較合適的，若貯存在25℃以上的溫度下， 抗體活性損失隨貯存期的延長(zhǎng)而不斷下降。 （e）加熱處理、蛋白酶處理以及冷凍干燥處理對(duì)抗體的活性都有不利的影響，但一定濃 度的乳糖、環(huán)糊精和糊精能加強(qiáng)抗體對(duì)熱處理和蛋白酶處理的穩(wěn)定性，而環(huán)糊精、乳糖、糊 精、果糖、葡萄糖、甘氨酸和甘油都能不同程度的加強(qiáng)抗體在冷凍干燥過(guò)程中的穩(wěn)定性。

（5）通過(guò)對(duì)抗人大腸桿菌免疫蛋黃抗體的功能及其機(jī)理探討發(fā)現(xiàn)，抗人人腸桿菌卵黃抗體 濃度大于sm留ml，可對(duì)大腸桿菌有明顯的體外抑菌作用;抗人大腸桿菌IgY對(duì)大腸桿菌誘導(dǎo) 的乳鼠腸道感染具有顯著的預(yù)防和治療作用;抗人大腸桿菌卵黃抗體可抑制大腸桿菌對(duì)腸上 皮細(xì)胞粘附作用，隨著大腸桿菌濃度的不斷升高，粘附率不斷增加，上皮細(xì)胞濃度的增加能 提高ETEC對(duì)其的粘附率。

（6）研究發(fā)現(xiàn)，4.0 kGy的“。c。丫射線可使蛋中可能污染的微生物全部滅活，而不影響 抗體活性;雞抗人大腸桿菌抗體對(duì)臨床檢查、血液學(xué)、生化學(xué)、器官重量、系數(shù)及組織病理 學(xué)等指標(biāo)無(wú)明顯影響，證明雞蛋黃抗體IgY無(wú)急、‘漫性毒副作用:通過(guò)骨髓嗜染紅細(xì)胞微核 試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)及Ames試驗(yàn)，結(jié)果證明雞抗人大腸桿菌抗體無(wú)細(xì)胞毒，無(wú)致突變作用。